文獻解讀
今年2月，南昌大學藥學院夏春華與劉方蘭團隊在Molecular Cancer期刊上發(fā)表題為“Hsa_circ_0125356 promotes gemcitabine resistance by modulating WNT canonical and non-canonical pathways via miR-582-5p/FGF9 axis in non-small cell lung cancer”的研究論文。 該研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種circRNA—hsa_circ_0125356，并進一步探討了其在非小細胞肺癌中對吉西他濱耐藥新機制。 研究背景 非小細胞肺癌（NSCLC）是全球癌癥發(fā)病率和死亡率最高的類型，嚴重威脅人類健康。盡管化療顯著提高了患者的預后，耐藥性的問題依然是制約其治療效果的主要障礙。尤其是吉西他濱（gemcitabine），作為常用的化療藥物，其耐藥性使得治療效果大打折扣。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA（circRNA）作為一種重要的非編碼RNA，可能在NSCLC的發(fā)展與化療耐藥性中發(fā)揮關鍵作用。通過調控miRNA和與蛋白質的相互作用，circRNA在多種癌癥的耐藥機制中扮演著重要角色，但在NSCLC中其具體作用機制尚待深入探討。 項目研究 首先作者構建了吉西他濱耐藥細胞模型 （A549-GR），通過測序確定了差異表達的circRNA，鎖定了hsa_circ_0125356 在 A549-GR 細胞中比其他候選 circRNA 表達量更高，測序顯示該基因由 SLC7A11 剪接而來，通過C引物和D引物進行擴增，發(fā)現(xiàn)不能通過 gDNA 擴增；通過FISH等發(fā)現(xiàn)其定位在細胞質中，通過與癌旁細胞相比，發(fā)現(xiàn)癌組織中的 hsa_circ_0125356 顯著上調，說明該基因可能參與了腫瘤進程。 Fig.1 NSCLC 中新型吉西他濱耐藥相關 circRNA 的發(fā)現(xiàn)和特征 通過對hsa_circ_0125356進行干擾及過表達操作，發(fā)現(xiàn)沒有吉西他濱處理的情況下，過表達或干擾circ_0125356幾乎不影響 A549 和 A549-GR 細胞的增殖和遷移能力；但是在有吉西他濱的存在下，hsa_circ_0125356干擾顯著抑制了 A549-GR 細胞的活力； 隨后通過凋亡，集落形成等實驗，證明hsa_circ_0125356促進了吉西他濱治療后 NSCLC 細胞的增殖、遷移和耐藥。 Fig.2 CircRNA-0125356 促進 NSCLC 細胞對吉西他濱的耐藥性 進一步數(shù)據(jù)庫預測，找到與circ_0125356可能存在調控的miRNA，通過對miRNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-582-5p與circ_0125356成負相關，并且通過FISH發(fā)現(xiàn)二者共定位在細胞質中，進一步通過雙熒光素酶報告基因檢測證明hsa_circ_0125356 充當 miR-582-5p 的 miRNA 海綿，并負向調節(jié) A549 和 A549-GR 細胞中的 miR-582-5p。
Fig.3 Hsa_circ_0125356 代表一種有效的 miR-582-5p miRNA 海綿
緊接著，作者又進一步研究了 miR-582-5p 對 NSCLC 細胞吉西他濱耐藥的生物學功能，通過miR-582-5p 模擬物處理，增強了 A549 細胞對吉西他濱的敏感性，轉染 hsa_circ_0125356 質粒后效果相反，通過一系列功能實驗驗證不同處理后對吉西他濱的敏感性，表明hsa_circ_0125356 通過海綿 miR-582-5p 促進 NSCLC 進展和吉西他濱耐藥，最終導致其致癌作用。
Fig.4 Hsa_circ_0125356 通過 miR-582-5p 調節(jié) NSCLC 細胞的腫瘤進展和吉西他濱耐藥
以上研究了circRNA與miRNA的調控，后半部分作者研究的是miRNA的靶基因的情況，通過預測及報告基因等實驗確定了FGF9為 miR-582-5p的下游靶基因。
Fig.5 FGF9 被鑒定為 miR-582-5p 的功能靶基因，可增強 NSCLC 細胞的吉西他濱耐藥性
為了研究上述機制和吉西他濱耐藥性的關系，作者對吉西他濱耐藥細胞模型進行了轉錄組測序，測序發(fā)現(xiàn)FGF9 在 A549-GR 細胞中的表達顯著高于 A549 細胞，通過對FGF9過表達/干擾發(fā)現(xiàn)在吉西他濱暴露下，A549-GR 細胞敲低 FGF9 后 IC 50 值顯著降低，表明 FGF9 敲低促進腫瘤細胞對吉西他濱更敏感。
接下來通過對細胞進行損傷處理，驗證吉西他濱敏感程度與FGF9 的關系，研究表明hsa_circ_0125356 通過海綿 miR-582-5p/FGF9 通路促進吉西他濱耐藥。
Fig.6 Hsa_circ_0125356 通過 miR-582-5p/FGF9 軸維持吉西他濱耐藥性
據(jù)研究顯示，FGF9 通過調節(jié) WNT 和絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信號通路與腫瘤進展和耐藥性相關。
因此作者結合這一情況，對FGF9在A549-GR 細胞中是否也是相同的作用情況展開研究，F(xiàn)GF9 過表達逆轉了吉西他濱處理后吉西他濱耐藥 A549-GR 細胞中經(jīng)典 WNT 通路相關蛋白、非經(jīng)典 WNT 通路相關蛋白和凋亡相關蛋白的變化等，隨后作者使用WNT 通路抑制劑，發(fā)現(xiàn)抑制劑在吉西他濱處理后消除了 IC50 值的變化，并形成了由hsa_circ_0125356過表達誘導的菌落，這些結果共同表明hsa_circ_0125356通過 WNT 經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路調節(jié) FGF9 的表達以維持吉西他濱耐藥。
Fig.7 FGF9 通過經(jīng)典和非經(jīng)典 WNT 信號通路增強吉西他濱耐藥性
作者通過構建小鼠模型，對以上細胞機制開展體內實驗，以驗證 hsa_circ_0125356 對體內吉西他濱耐藥性的影響，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0125356通過體內 WNT 經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路調節(jié) miR-582-5p/FGF9 軸以增強 NSCLC 中的吉西他濱耐藥性。
Fig.8 Hsa_circ_0125356 通過 WNT 經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路促進 NSCLC 中的吉西他濱耐藥
研究結論
綜上所述，研究首次證明hsa_circ_0125356為非小細胞肺癌中吉西他濱耐藥的生物標志物，通過吸附miR-582-5p/FGF9軸調控WNT經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路，為識別治療非小細胞肺癌吉西他濱耐藥的靶點提供了新的方向。
Hsa_circ_0125356 通過 WNT 經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路促進 NSCLC 中的吉西他濱耐藥
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