背景介紹
慢病毒
慢病毒（Lentivirus,LV）是逆轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個屬，其基因結(jié)構(gòu)和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒類似。包含RNA和蛋白，遺傳信息儲存在RNA中，衣殼糖蛋白與細(xì)胞膜上特異受體結(jié)合而進(jìn)入易感靶細(xì)胞。其RNA進(jìn)入靶細(xì)胞，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。是目前細(xì)胞及模式生物實驗中非常有效的基因研究工具。
慢病毒載體
慢病毒載體則是以慢病毒基因組為基礎(chǔ)，對慢病毒自身的元件，如LTR，Gag，Pol，Env等進(jìn)行改造而發(fā)展起來的一類能夠攜帶外源基因的病毒載體。目前以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)改造而來的慢病毒載體最為常用，它可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，實現(xiàn)目的基因的長期、穩(wěn)定表達(dá)。 慢病毒包裝 慢病毒包裝，則是將生產(chǎn)病毒所需的組件拆分為多個質(zhì)粒（第2代系統(tǒng)為3個，第3代系統(tǒng)為4個），質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到包裝用的細(xì)胞（HEK293T）中，進(jìn)而產(chǎn)生慢病毒顆粒。 吉滿生物擁有14年+的慢病毒包裝服務(wù)經(jīng)驗，秉承“服務(wù)至上，品質(zhì)為先”的理念，已為近25000名科研用戶提供專業(yè)的技術(shù)支持和售后解答。 本篇列舉了慢病毒包裝實驗過程中的9個常見問題，供各位老師學(xué)習(xí)參考！ 慢病毒包裝實驗Q&A 如何確定某株細(xì)胞的MOI值？ MOI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）是指每個細(xì)胞感染的病毒數(shù)。通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量越多，也代表了病毒對細(xì)胞的感染能力，MOI越高，細(xì)胞越難被感染。 MOI值高低多受細(xì)胞本身影響，不同實驗室細(xì)胞狀態(tài)等差異可能導(dǎo)致細(xì)胞MOI值有區(qū)別，建議實驗前都先用帶有GFP的對照病毒進(jìn)行MOI預(yù)實驗摸索合適MOI值，進(jìn)而確定病毒用量，通過文獻(xiàn)或參考數(shù)據(jù)設(shè)置預(yù)實驗感染梯度，如MOI較高可選擇高滴度病毒或促感染試劑進(jìn)行優(yōu)化。 可通過如下公式進(jìn)行計算MOI或病毒用量： MOI=病毒滴度×感染的病毒量/細(xì)胞個數(shù) 如何提高慢病毒對細(xì)胞的感染效率？ 慢病毒對細(xì)胞的感染效率受多種因素影響，如細(xì)胞自身生長狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞被慢病毒感染的難易程度（MOI）等，因此保證細(xì)胞正常增殖，輪廓清晰，合適的細(xì)胞密度，選擇最優(yōu)的感染條件可以更好的保證感染效率。 對于懸浮細(xì)胞，可采用離心感染的方法，減少病毒感染時的體積，從而提高感染效率，如將細(xì)胞培養(yǎng)板密封后，用平角轉(zhuǎn)子離心機1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。 慢病毒感染細(xì)胞后什么時候基因表達(dá)到達(dá)峰值？ 慢病毒表達(dá)時間較慢，一般代謝旺盛的細(xì)胞（如293T、BHK21等）48h后可以觀察到GFP熒光（或者RFP紅色熒光）； 代謝比較緩慢的細(xì)胞（如原代培養(yǎng)細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等）GFP（RFP）蛋白表達(dá)所需時間較長，感染后72-96h甚至更長時間可以觀察到GFP（RFP）熒光。 過表達(dá)慢病毒因載體中插入目的基因序列，可能熒光相比對照病毒稍弱；如載體中帶有cas9/dcas9等較大蛋白，建議感染后7~10天再繼續(xù)下游實驗。感染后期請根據(jù)細(xì)胞生長的情況對細(xì)胞進(jìn)行換液或傳代，以保證良好的生長狀態(tài)。 細(xì)胞能被慢病毒感染，但為何熒光很弱？ 慢病毒感染細(xì)胞后，由于目的基因與熒光蛋白表達(dá)的方式不一樣，導(dǎo)致熒光表達(dá)有差異的情況也時有發(fā)生。細(xì)胞中熒光強度受病毒載體及細(xì)胞等因素影響。 融合熒光：目的基因與熒光蛋白融合表達(dá)，少數(shù)的目的基因?qū)θ诤系臒晒獾鞍椎臒晒庥杏绊??？赡苁悄康幕虮磉_(dá)量低，導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)量也低，進(jìn)而熒光不亮；也可能是目的基因?qū)晒獾鞍椎慕Y(jié)構(gòu)和功能有影響，導(dǎo)致熒光不亮。 IRES連接：使用目的基因-IRES-熒光蛋白的結(jié)構(gòu)，由于IRES下游基因表達(dá)偏弱，容易導(dǎo)致熒光弱。 2A連接：使用目的基因-2A-熒光蛋白結(jié)構(gòu)，2A上游的目的基因和下游熒光蛋白在蛋白翻譯時斷開，如果上游目的基因表達(dá)量低，也會導(dǎo)致下游熒光蛋白表達(dá)受影響，導(dǎo)致熒光弱，此外，2A元件連接斷開不完全，可能存在融合表達(dá)同樣存在影響。 啟動子影響：目的基因和熒光蛋白使用不同的啟動子表達(dá)，熒光蛋白接在強啟動子后面時熒光表達(dá)強，接在弱啟動子后面時熒光表達(dá)較弱，同時，不同類型的啟動子在不同細(xì)胞中啟動效果也會有影響，某些細(xì)胞可能需要特殊的啟動子啟動熒光或者目的基因表達(dá)。 細(xì)胞增殖及觀察時間：通常目的細(xì)胞感染的慢病毒顆粒數(shù)越多，細(xì)胞本身增殖越快，熒光會越強；慢病毒在增殖較快的細(xì)胞中感染96~120h后，熒光蛋白表達(dá)才達(dá)到峰值；在增殖較慢的細(xì)胞中感染后，熒光蛋白表達(dá)達(dá)到峰值需要更長的時間。 為什么過表達(dá)慢病毒沒有對照病毒的熒光強？ 和病毒的容量有關(guān)，插入較長基因后，熒光強度會隨著插入基因的長度或特殊結(jié)構(gòu)（高GC）的存在而減弱，尤其是高GC片段，由于影響了轉(zhuǎn)錄，熒光強度會降低；另外，對照病毒的滴度相對較高，同等體積的病毒，對照的病毒量大。 曝光時間很長才能觀察到熒光？ 排除熒光顯微鏡問題：看對照病毒，如對照病毒也不亮屬于顯微鏡問題； PH值：若PH值較低，會導(dǎo)致綠色熒光猝滅，可根據(jù)培養(yǎng)基顏色判斷（是否發(fā)黃）； 目的基因的慢病毒可能會比對照病毒的光弱一些，屬于正?，F(xiàn)象，可延長曝光時間。 慢病毒通?？梢匝b多大的基因？ 通常情況下，需要構(gòu)建的基因長度（含有標(biāo)記基因在內(nèi)）不超過4kb。 因為慢病毒表達(dá)載體包含了5’LTR、3’LTR、WPRE等相關(guān)元件，一般情況下整個LTR長度與滴度相關(guān)，載體越大，病毒滴度越低，可通過載體情況及構(gòu)建序列長度對病毒滴度進(jìn)行預(yù)估。 慢病毒載體不包病毒能不能當(dāng)質(zhì)粒用？ 不包病毒的慢病毒質(zhì)?？捎糜谒厕D(zhuǎn)，類似于普通載體質(zhì)粒，但裝載序列的慢病毒載體整體較大，通常情況下，載體越大，瞬轉(zhuǎn)效率越低。 有現(xiàn)成的慢病毒質(zhì)粒能不能直接用于吉滿的病毒包裝？ 對于客戶提供的慢病毒載體質(zhì)粒，由于載體系統(tǒng)的來源及結(jié)構(gòu)的不同，包裝病毒時在兼容性、產(chǎn)量、滴度等方面都可能存在有差異。 吉滿使用二三代兼容的包裝系統(tǒng)，會先對提供的質(zhì)粒進(jìn)行售前評估，如包裝風(fēng)險較大，建議換我們常用載體對包裝滴度更有保障，低風(fēng)險質(zhì)?？蛇M(jìn)行少量包裝確定滴度再進(jìn)行大量擴增。 慢病毒包裝服務(wù) 吉滿生物可提供一系列慢病毒現(xiàn)貨產(chǎn)品（過表達(dá)、永生化、iPS、自噬、CRE、亞細(xì)胞定位等）及定制服務(wù)。 吉滿生物在包裝過程中，采用專業(yè)的工藝和標(biāo)準(zhǔn)化的流程，確保產(chǎn)品的純度和活性，助力科研工作順利推進(jìn)。從質(zhì)粒構(gòu)建到病毒包裝僅需5周即可發(fā)貨！ 更多產(chǎn)品與服務(wù)歡迎訪問吉滿生物官網(wǎng)：www.zxpdf.cn
