文獻(xiàn)解析
小膠質(zhì)細(xì)胞活化是阿爾茨海默病（AD）早期事件，不僅在Aβ斑塊形成前發(fā)生，其異常增生和功能障礙會(huì)加重淀粉樣病理，并通過(guò)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)損傷，同時(shí)多種阿爾茨海默病易感基因在小膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，提示其在疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但具體的細(xì)胞機(jī)制尚未明了。
環(huán)狀RNA（circRNA）是一類(lèi)在腦組織富集且功能多樣的內(nèi)源性非編碼RNA，因其穩(wěn)定性和特異性備受關(guān)注，并被發(fā)現(xiàn)與阿爾茨海默?。ˋD）嚴(yán)重程度密切相關(guān)。盡管已有研究揭示circRNA在AD患者和模型中表達(dá)失調(diào)，且神經(jīng)元和部分非神經(jīng)元細(xì)胞中的circRNA譜系被報(bào)道，但小膠質(zhì)細(xì)胞中circRNA的表達(dá)特征及其在AD相關(guān)神經(jīng)炎癥中的作用尚不明確，因此系統(tǒng)研究小膠質(zhì)細(xì)胞circRNA的表達(dá)譜及功能將為理解AD的發(fā)病機(jī)制帶來(lái)新見(jiàn)解。
文獻(xiàn)來(lái)源
今年2月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王昊教授團(tuán)隊(duì)在《Theranostics》期刊上發(fā)表題為“Microglial circDlg1 modulates neuroinflammation by blocking PDE4B ubiquitination-dependent degradation associated with Alzheimer’s disease” 的研究性論文。
研究首次揭示小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)的circDlg1可調(diào)控AD相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)答，其介導(dǎo)的PDE4B翻譯后調(diào)控新機(jī)制為開(kāi)發(fā)靶向小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)答的AD治療策略提供了新思路。
項(xiàng)目研究
為探究circRNAs在AD小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用，作者采用CD11b抗體磁珠分選法（MACS），從6月齡雄性野生型（WT）和APP/PS1（AD模型）小鼠皮層中分離小膠質(zhì)細(xì)胞。
通過(guò)circRNA微陣列分析及多步篩選流程，在除線粒體染色體外的所有染色體上共檢測(cè)到13420個(gè)circRNAs，與WT小鼠相比，APP/PS1小鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞中存在218個(gè)差異表達(dá)circRNAs，包括146個(gè)上調(diào)circRNAs和72個(gè)下調(diào)circRNAs。
進(jìn)一步篩選得到9個(gè)符合以下標(biāo)準(zhǔn)的circRNAs：
（1）收錄于circBase數(shù)據(jù)庫(kù)
（2）長(zhǎng)度200~2000 bp
（3）Rybak-Wolf等報(bào)道的人鼠保守circRNA
RT驗(yàn)證結(jié)果表明，其中6個(gè)circRNAs在APP/PS1小鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)顯著改變，選取豐度分析中最高的3個(gè)circRNAs，在LPS刺激的小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系中檢測(cè)，結(jié)果顯示，僅circDlg1表達(dá)上調(diào)。
AD小鼠組織水平RT檢測(cè)分析，circDlg1在AD易損腦區(qū)皮層和海馬中高表達(dá)；熒光原位雜交（FISH）結(jié)合免疫染色顯示，circDlg1在APP/PS1小鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性上調(diào)，而在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中無(wú)顯著變化。此外，AD患者小膠質(zhì)細(xì)胞中circDLG1表達(dá)也顯著高于健康對(duì)照組。上述結(jié)果表明，circDlg1的表達(dá)量在AD小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性上調(diào)。
圖1 CircDlg1在AD的小膠質(zhì)細(xì)胞和LPS處理的BV-2細(xì)胞中特異性上調(diào)
研究表明，通過(guò)將促炎型M1小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗炎型M2，可有效激活小膠質(zhì)細(xì)胞在AD中的保護(hù)功能。
為此，作者探究了circDlg1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)控作用。在BV-2細(xì)胞中敲低circDlg1可顯著上調(diào)M2標(biāo)志物，Arg1和CD206；下調(diào)M1標(biāo)志物，iNOS和CD86。LPS處理導(dǎo)致的M2標(biāo)志物減少和M1標(biāo)志物增加現(xiàn)象，可被circDlg1敲低有效逆轉(zhuǎn)。進(jìn)而說(shuō)明circDlg1是小膠質(zhì)細(xì)胞極化的關(guān)鍵調(diào)控開(kāi)關(guān)，其下調(diào)可能激活小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)性功能。
此外，小膠質(zhì)細(xì)胞的淀粉樣蛋白吞噬活性可直接影響Aβ斑塊病理中的清除效率。為驗(yàn)證circDlg1是否調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的Aβ攝取能力，作者通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。在BV-2細(xì)胞和原代小膠質(zhì)細(xì)胞中，circDlg1敲低均顯著促進(jìn)Aβ42-FAM的攝取，免疫染色結(jié)果同樣顯示Aβ42-FAM吞噬顯著增加。這些結(jié)果證實(shí)circDlg1在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞Aβ吞噬活性中起重要作用。綜上，circDlg1在AD病理中對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)答Aβ沉積具有關(guān)鍵調(diào)控作用。
圖2 circDlg1的敲除促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化和體外淀粉樣蛋白攝取
基于上述體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，作者后續(xù)進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)闡明circDlg1的分子機(jī)制。選用6月齡雄性WT和APP/PS1小鼠，側(cè)腦室注射帶有Iba1啟動(dòng)子（小膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子）的AAV9腺相關(guān)病毒（Iba1-sh-circCon/Iba1-sh-circDlg1）。注射兩個(gè)月后，取樣檢測(cè)。RT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，APP/PS1-Iba1-sh-circDlg1小鼠CD11b+小膠質(zhì)細(xì)胞中circDlg1的表達(dá)顯著降低，而CD11b-細(xì)胞無(wú)顯著變化，且線性Dlg1的mRNA水平未受影響。
此外，circDlg1敲低使APP/PS1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)區(qū)域性激活差異：Aβ斑塊30 μm范圍內(nèi)激活增強(qiáng)，而遠(yuǎn)端區(qū)域激活減弱。形態(tài)學(xué)分析顯示，circDlg1敲低后小膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量增加、長(zhǎng)度延伸。通過(guò)定量Aβ斑塊30 μm范圍內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞覆蓋面積和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)circDlg1下調(diào)顯著促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向斑塊的募集與包裹。
RT結(jié)果顯示，APP/PS1-Iba1-sh-circDlg1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中穩(wěn)態(tài)標(biāo)志基因Tmem119表達(dá)顯著上調(diào)，而疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞（DAM）特征基因（Trem2、Tyrobp、ApoE、LpI、AxI、Cst7、Clec7a）表達(dá)降低。同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞、皮層及海馬中促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）和膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物（Aif1、GFAP）表達(dá)均顯著下降。上述結(jié)果證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲低circDlg1能有效增強(qiáng)其與Aβ斑塊的相互作用，并改善APP/PS1小鼠的神經(jīng)炎癥狀態(tài)。
圖3 小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲低circDlg1可改善APP/PS1小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)和神經(jīng)炎癥
隨后作者開(kāi)展了系統(tǒng)的神經(jīng)病理學(xué)分析，以深入探究小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲低circDlg1對(duì)AD相關(guān)病理的改善作用。在APP/PS1-Iba1-sh-circDlg1小鼠中，AD典型病理特征—皮層和海馬區(qū)的Aβ斑塊負(fù)荷顯著減輕，這一現(xiàn)象與小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ斑塊包裹率升高相吻合。同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞激活減弱和炎癥因子減少共同導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞活化降低以及Lamp1+營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)突減少。
為驗(yàn)證circDlg1敲低能否將病理改善轉(zhuǎn)化為認(rèn)知功能恢復(fù)，通過(guò)Y迷宮、新物體識(shí)別（NOR）和莫里斯水迷宮（MWM）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估。
Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，APP/PS1-Iba1-sh-circCon小鼠的自發(fā)交替率較WT對(duì)照組顯著降低，而circDlg1敲低可阻止這種短期記憶衰退，四組小鼠的運(yùn)動(dòng)功能（總進(jìn)入次數(shù)）無(wú)差異。
NOR實(shí)驗(yàn)同樣顯示，APP/PS1-Iba1-sh-circDlg1小鼠的識(shí)別記憶能力較對(duì)照組明顯改善。四組小鼠游泳速度無(wú)差異，運(yùn)動(dòng)軌跡如圖中所示。這些結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲低circDlg1能有效挽救APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能損傷。
MWM訓(xùn)練階段，circDlg1敲低組小鼠找到隱藏平臺(tái)的潛伏期顯著縮短，提示空間學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)；在撤除平臺(tái)的探測(cè)試驗(yàn)中，circDlg1敲低可逆轉(zhuǎn)APP/PS1小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間和游泳距離的減少。
四組小鼠游泳速度無(wú)差異，運(yùn)動(dòng)軌跡如圖中所示。這些結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲低circDlg1能有效挽救APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能損傷。
圖4 小膠質(zhì)細(xì)胞中circDlg1的下調(diào)可減輕APP/PS1小鼠的AD病理和認(rèn)知功能障礙
鑒于circRNA普遍參與蛋白質(zhì)相互作用，作者通過(guò)RNA pulldown聯(lián)合質(zhì)譜分析（MS）鑒定WT小鼠皮層中circDlg1的結(jié)合蛋白。
生物素標(biāo)記的circDlg1探針共捕獲34個(gè)蛋白，其中24個(gè)在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)?；趇BAQ定量和MS/MS計(jì)數(shù)結(jié)果，篩選出評(píng)分最高的5個(gè)候選蛋白（PDE4B、Sfpq、Hnrnpa1、Pura和Hnrnpg）。免疫共沉淀驗(yàn)證circDlg1與這5個(gè)蛋白均存在相互作用。值得注意的是，PDE4B的表達(dá)在LPS激活的BV-2細(xì)胞中上調(diào)最顯著。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)僅circDlg1能被PDE4B特異性捕獲。FISH-免疫熒光共定位顯示，circDlg1與PDE4B在BV-2細(xì)胞質(zhì)中高度共定位（Pearson R=0.77）。
在PDE4B亞型中，PDE4B1-3和PDE4B5具有人鼠保守性。其中PDE4B2對(duì)炎癥刺激敏感，與炎癥因子和趨化因子表達(dá)密切相關(guān)，可啟動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥基因表達(dá)程序。RT結(jié)果顯示6月齡WT小鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞中PDE4B2表達(dá)量最高，其次為PDE4B3、PDE4B1和PDE4B5。在circDlg1與PDE4B質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，RNA pulldown證實(shí)circDlg1與PDE4B1-3強(qiáng)結(jié)合。通過(guò)構(gòu)建Flag標(biāo)記的全長(zhǎng)及截短體PDE4B1質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)circDlg1特異性結(jié)合N端靶向結(jié)構(gòu)域（TD）。這些結(jié)果共同表明，circDlg1通過(guò)結(jié)合PDE4B的N端TD結(jié)構(gòu)域發(fā)揮調(diào)控作用。
圖5 CircDlg1與小膠質(zhì)細(xì)胞中磷酸二酯酶4b（PDE4B）的N端靶向結(jié)構(gòu)域（TD）相互作用
PDE4B是一種主要的cAMP代謝酶，主要參與調(diào)節(jié)包括小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
為探究小膠質(zhì)細(xì)胞中PDE4B敲低的作用，作者在6月齡雄性WT和APP/PS1小鼠側(cè)腦室注射攜帶Iba1啟動(dòng)子的AAV9病毒（Iba1-shCon/Iba1-shPDE4B），2個(gè)月后評(píng)估認(rèn)知功能。
EGFP與Iba1共定位及CD11b+細(xì)胞中PDE4B的mRNA表達(dá)降低證實(shí)AAV病毒感染成功。免疫染色顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲低PDE4B不影響皮層總PDE4B蛋白，但顯著降低小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)PDE4B的表達(dá)。形態(tài)學(xué)分析表明，APP/PS1-Iba1-shCon小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)突起減少的異常激活態(tài)，而PDE4B敲低可明顯改善這種病理形態(tài)。RT結(jié)果表明，干擾PDE4B表達(dá)后，神經(jīng)炎癥相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)。
鑒于小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥會(huì)促進(jìn)Aβ斑塊生成，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)APP/PS1-Iba1-shPDE4B小鼠Aβ斑塊沉積顯著減少。莫里斯水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，PDE4B敲低組在4天訓(xùn)練階段找到隱藏平臺(tái)的潛伏期明顯縮短，探測(cè)試驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)，而游泳速度無(wú)組間差異。這些結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞PDE4B表達(dá)下調(diào)可緩解神經(jīng)炎癥、減輕Aβ病理并改善APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶缺陷。
圖6 小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除PDE4B限制了神經(jīng)炎癥的程度，減輕了AD病理
已有研究報(bào)道，PDE4亞型的獨(dú)特N端TD結(jié)構(gòu)域參與翻譯后修飾過(guò)程。鑒于circDlg1通過(guò)N端TD與PDE4B結(jié)合，且PDE4B在APP/PS1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，作者深入探究了circDlg1對(duì)PDE4B的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示：在小膠質(zhì)細(xì)胞中，circDlg1敲低可降低PDE4B蛋白水平，而過(guò)表達(dá)則增加其表達(dá)，但均不影響PDE4B的mRNA水平，提示存在翻譯后修飾機(jī)制。
使用蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理發(fā)現(xiàn)，circDlg1 siRNA處理的BV-2細(xì)胞中PDE4B蛋白降解速率加快；而轉(zhuǎn)錄抑制劑AcD處理下，circDlg1 siRNA對(duì)PDE4B mRNA水平無(wú)影響，表明circDlg1主要調(diào)控PDE4B蛋白穩(wěn)定性。
在泛素-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑這兩個(gè)蛋白降解機(jī)制中，circDlg1敲低導(dǎo)致的PDE4B蛋白減少可被蛋白酶體抑制劑MG-132和硼替佐米（Bort）逆轉(zhuǎn)，而溶酶體抑制劑氯喹（Chlo）無(wú)此作用，說(shuō)明circDlg1主要通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控PDE4B蛋白的降解。與此一致，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平與PDE4B蛋白呈負(fù)相關(guān)波動(dòng)。
此外，circDlg1敲低顯著增強(qiáng)PDE4B的泛素化修飾。已知E3泛素連接酶Smurf2可特異性促進(jìn)PDE4B的泛素化降解，RNA pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)circDlg1與Smurf2存在相互作用，三者形成circDlg1-PDE4B-Smurf2三元復(fù)合體。值得注意的是，circDlg1敲低雖不改變Smurf2蛋白水平，但能增強(qiáng)PDE4B與Smurf2的結(jié)合。這些結(jié)果表明，該三元復(fù)合體通過(guò)阻礙PDE4B的泛素化依賴(lài)性降解維持其蛋白穩(wěn)定性。
圖7 CircDlg1保護(hù)PDE4B免受泛素依賴(lài)性降解
鑒于小膠質(zhì)細(xì)胞PDE4B敲低可激活PKA/CREB抗炎通路，且circDlg1調(diào)控PDE4B蛋白水平，作者在體內(nèi)驗(yàn)證了circDlg1-PDE4B調(diào)控通路。
免疫熒光顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞中circDlg1下調(diào)雖不影響皮層總PDE4B熒光強(qiáng)度，但顯著降低小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)PDE4B的表達(dá)。CD11b+細(xì)胞、CD11b-細(xì)胞及皮層/海馬組織中PDE4B的mRNA表達(dá)均無(wú)變化。Western blot進(jìn)一步證實(shí)，僅APP/PS1-Iba1-sh-circDlg1小鼠的CD11b+小膠質(zhì)細(xì)胞中PDE4B蛋白表達(dá)減少。
機(jī)制上，小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲低circDlg1可顯著增加磷酸化PKA（p-PKA）及磷酸化CREB（p-CREB）的蛋白表達(dá)水平，表明PDE4B下游關(guān)鍵的PKA/CREB抗炎信號(hào)通路被激活。相關(guān)性分析顯示，circDlg1表達(dá)與p-PKA、p-CREB呈顯著負(fù)相關(guān)，且circDlg1敲低促使p-PKA在胞質(zhì)和核內(nèi)分布增加。此外，circDlg1水平與PDE4B呈正相關(guān)，與記憶保持能力呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果證實(shí)，下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞circDlg1可通過(guò)降低PDE4B蛋白水平，激活PKA/CREB抗炎信號(hào)通路，從而改善APP/PS1小鼠的AD神經(jīng)病理。
圖8 APP/PS1小鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除circDlg1通過(guò)下調(diào)PDE4B激活PKA/CREB抗炎信號(hào)通路
研究結(jié)論
本研究首次揭示AD患者及APP/PS1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中異常上調(diào)的circDlg1，并證實(shí)特異性敲低該circRNA或其下游效應(yīng)分子PDE4B，即可維持小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)性應(yīng)答、抑制促炎基因程序、減輕AD神經(jīng)炎癥，從而拓展了對(duì)AD小膠質(zhì)細(xì)胞中circRNA特異性調(diào)控的認(rèn)知邊界。另外，circDlg1通過(guò)N端TD結(jié)構(gòu)域調(diào)控PDE4B泛素化修飾的發(fā)現(xiàn)，將為開(kāi)發(fā)更精準(zhǔn)安全的AD靶向治療策略提供全新理論依據(jù)。
原文引用
“CircDlg1, Flag-PDE4B1, Flag-PDE4B2, Flag-PDE4B3, and truncations of Flag-PDE4B1 plasmids were purchased from Genomeditech Co. Ltd (Shanghai, China). ”
文獻(xiàn)原文
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40093898/
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